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Ni-NTA琼脂糖凝胶FF
品 名：Ni-NTA琼脂糖凝胶FF(镍-次氮基三乙酸琼脂糖凝胶FF，Nickel Nitrilotriacetic acid NUPharose Fast Flow, Ni-NTA NUPharose FF)
目 录 号：NRPB57S(预装柱)
规 格：1 ml预装柱，5 ml预装柱
贮 存：20%乙醇，2-25℃
运 输：2-30℃，常压、避光
保 质 期：5年
相关介绍：
Ni-NTA琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联次氮基三乙酸（NTA），再螯合Ni2+。与亚氨基二乙酸（IDA）相比，具有更好的螯合剂、还原剂、碱性的耐受性，如样品中含有1-10mM EDTA或1-10mM β-巯基乙醇或5mM DTT，可正常纯化；在螯合镍的情况下，也可以用0.1M NaOH清洗。
Ni-NTA琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni2+形成稳定的配位键，因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了His-Tag重组蛋白的Ni-NTA琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。
技术指标：
基质 | 4%琼脂糖凝胶 |
配基 | -N(CH2COOH)3 |
配基密度 | ≥15 μmol/ml |
填料粒径 | 60~180 μm |
**流速 | 800 cm/h |
推荐流速 | 50-100 cm/h |
pH稳定性 | pH 5-12，pH 3~13 |
耐反压 | 0.3 MPa |
载量 | ≥20 mg His-tag重组蛋白/ml |
使用方法：
1、色谱柱装填
（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体**做脱气处理。
（2）在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。
（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。
（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则正常流速下填装。
（5）填装好的Ni-NTA琼脂糖凝胶FF柱用2-5个柱体积的初始缓冲溶液平衡，建议流速100cm/h，平衡后的柱子可以用于His-Tag重组蛋白的上样和洗脱纯化。
2、上样
（1）缓冲液选择：一般选用pH6-8的结合缓冲液，常用缓冲液有10-00mM 磷酸钠缓冲液、20-200mM Tris-HCl缓冲液等。在缓冲液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。在初次使用Ni-NTA琼脂糖凝胶FF，推荐使用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为结合缓冲液。
（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。为保证缓冲液一致，可以在结合缓冲液中破碎细菌、或调解pH与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用方法有透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用结合缓冲液稀释2-10倍等。样品上柱前应0.45μm过滤。
3、洗脱
（1）Ni-NTA琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。
（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH。
（3）在初次使用Ni-NTA琼脂糖凝胶FF，不知道洗脱的咪唑浓度，建议在结合缓冲液中分别加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，浓度从低到高，分别洗脱和收集，通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱组份。
（4）有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。
4、在位清洗
在多次使用后需要在位清洗，常用方法为先5个柱体积蒸馏水清洗，再用1-3个柱体积50mM NaOH清洗10-20min，立即用5个柱体积结合缓冲液（50mM PBS）清洗平衡。